منتجات
مجموعة Lifecosm للكشف عن فيروس كورونا المستجد 2019-nCoV بتقنية RT-PCR
الاستخدام المتوقع
تُستخدم هذه المجموعة للكشف النوعي عن فيروس كورونا الجديد (2019-nCoV) باستخدام مسحات الحلق ومسحات البلعوم الأنفي وسائل غسيل القصبات الهوائية والبلغم. إن نتيجة الكشف لهذا المنتج هي للإشارة السريرية فقط، ولا ينبغي استخدامها كدليل وحيد للتشخيص السريري والعلاج. يوصى بإجراء تحليل شامل للحالة بالاشتراك مع المظاهر السريرية للمريض واختبارات المعمل الأخرى.
مبدأ التفتيش
تعتمد هذه المجموعة على تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (PCR) بخطوة واحدة. في الواقع، تم اختيار جينات فيروس كورونا المستجد 2019 (2019-nCoV) ORF1ab وN كمناطق مستهدفة للتضخيم. صُممت بادئات ومسبارات فلورية خاصة (مسبارات الجين N موسومة بـ FAM ومسبارات ORF1ab موسومة بـ HEX) للكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA) لفيروس كورونا المستجد 2019 في العينات. تتضمن المجموعة أيضًا نظام كشف داخلي للتحكم (مسبار جين التحكم الداخلي موسوم بـ CY5) لمراقبة عملية جمع العينات، وتضخيم الحمض النووي الريبوزي (RNA) وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، مما يقلل من النتائج السلبية الكاذبة.
المكونات الرئيسية
| عناصر | مقدار(48T/طقم) |
| محلول تفاعل RT-PCR | 96 ميكرولتر |
| التمهيدي لـ nCOV، خليط مسبار TaqMan (ORF1ab، N Gene، RnaseP Gene) | 864 ميكرولتر |
| الرقابة السلبية | 1500 ميكرولتر |
| التحكم الإيجابي لـ nCOV (جين ORF1ab N) | 1500 ميكرولتر |
الكواشف الخاصة: كواشف استخلاص أو تنقية الحمض النووي الريبوزي (RNA). الضبط السلبي/الإيجابي: الضبط الإيجابي هو الحمض النووي الريبوزي (RNA) المحتوي على القطعة المستهدفة، بينما الضبط السلبي هو الماء الخالي من الأحماض النووية. أثناء الاستخدام، يجب أن تشارك هذه الكواشف في عملية الاستخلاص، ويجب اعتبارها مُعدية. يجب التعامل معها والتخلص منها وفقًا للوائح ذات الصلة.
الجين المرجعي الداخلي هو جين RnaseP البشري.
شروط التخزين وتاريخ انتهاء الصلاحية
-20±5℃، تجنب التجميد والذوبان المتكرر أكثر من 5 مرات، صالح لمدة 6 أشهر.
الأداة المعمول بها
مع FAM / HEX / CY5 وأجهزة PCR الفلورية متعددة القنوات الأخرى.
متطلبات العينة
1. أنواع العينات القابلة للتطبيق: مسحات الحلق، مسحات البلعوم الأنفي، سائل غسيل القصبات الهوائية، البلغم.
2. جمع العينات (تقنية التعقيم)
مسحة البلعوم: امسح اللوزتين وجدار البلعوم الخلفي بمسحتين في نفس الوقت، ثم اغمر رأس المسحة في أنبوب اختبار يحتوي على محلول أخذ العينات
البلغم: بعد السعال العميق للمريض، يُجمع البلغم الناتج عن السعال في أنبوب اختبار ذي غطاء لولبي يحتوي على محلول أخذ العينات؛ سائل غسل القصبات الهوائية: يُؤخذ العينة من قِبل متخصصين طبيين. 3. تخزين ونقل العينات
يجب فحص عينات عزل الفيروس واختبار الحمض النووي الريبوزي (RNA) في أسرع وقت ممكن. يمكن تخزين العينات التي يمكن اكتشافها خلال ٢٤ ساعة عند درجة حرارة ٤ درجات مئوية؛ أما العينات التي لا يمكن اكتشافها خلال ٢٤ ساعة، فيمكن تخزينها في درجة حرارة
يجب تخزين الساعات عند -70 درجة مئوية أو أقل (إذا لم تكن هناك ظروف تخزين عند -70 درجة مئوية، فيجب تخزينها
يُحفظ مؤقتًا في ثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. يجب تجنب تجميد العينات وإذابتها بشكل متكرر أثناء النقل. يجب إرسال العينات إلى المختبر في أسرع وقت ممكن بعد جمعها. في حال الحاجة إلى نقل العينات لمسافات طويلة، يُنصح بتخزينها بالثلج الجاف.
طرق الاختبار
1 معالجة العينات واستخراج الحمض النووي الريبي (منطقة معالجة العينات)
يُنصح بأخذ 200 ميكرولتر من العينة السائلة لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA). للاطلاع على خطوات الاستخلاص ذات الصلة، يُرجى مراجعة تعليمات مجموعات استخلاص الحمض النووي الريبوزي التجارية.
تم استخدام عناصر التحكم الموجودة في هذه المجموعة في عملية الاستخراج.
2 تحضير كاشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (منطقة تحضير الكاشف)
٢.١ أزل جميع المكونات من المجموعة، ثم قم بتذويبها وخلطها في درجة حرارة الغرفة. استخدم جهاز الطرد المركزي بسرعة ٨٠٠٠ دورة في الدقيقة لبضع ثوانٍ قبل الاستخدام؛ ثم احسب الكمية المطلوبة من الكواشف، ويُجهّز نظام التفاعل كما هو موضح في الجدول التالي:
| عناصر | حصة N (نظام 25 ميكرولتر) |
| خليط مسبار TaqMan التمهيدي لـ nCOV | 18 ميكرولتر × ن |
| محلول تفاعل RT-PCR | 2 ميكرولتر × ن |
| *ن = عدد العينات التي تم اختبارها + 1 (مجموعة التحكم السلبية) + 1 (nCOV(التحكم الإيجابي) | |
2.2 بعد خلط المكونات جيدًا، قم بالطرد المركزي لفترة قصيرة للسماح لكل السائل الموجود على جدار الأنبوب بالسقوط في قاع الأنبوب، ثم قم بتقسيم نظام التضخيم 20 ميكرولتر إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل.
3 أخذ العينات (منطقة تحضير العينة)
أضف ٥ ميكرولتر من العينات الموجبة والسالبة بعد الاستخلاص. يُضاف الحمض النووي الريبوزي (RNA) للعينة المراد فحصها إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
قم بإغلاق الأنبوب بإحكام ثم قم بطرده بسرعة 8000 دورة في الدقيقة لعدة ثوانٍ قبل نقله إلى منطقة اكتشاف التضخيم.
4 تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (منطقة الكشف المكبرة)
4.1 ضع أنبوب التفاعل في خلية العينة الخاصة بالجهاز، واضبط المعلمات على النحو التالي:
| منصة | دورة رقم | درجة حرارة(°م) | وقت | مجموعةموقع |
| يعكسالنسخ | 1 | 42 | 10 دقائق | - |
| ما قبل التحللn | 1 | 95 | دقيقة واحدة | - |
| دورة | 45 | 95 | 15 ثانية | - |
| 60 | الثلاثينيات | جمع البيانات |
اختيار قناة كشف الجهاز: اختر قناة FAM، HEX، CY5 لإشارة الفلورسنت. للإشارة الفلورسنتية المرجعية، يُرجى عدم اختيار ROX.
5 تحليل النتائج (يرجى الرجوع إلى التعليمات التجريبية لكل جهاز للإعداد)
بعد التفاعل، احفظ النتائج. بعد التحليل، اضبط قيمة البداية وقيمة النهاية وقيمة العتبة لخط الأساس وفقًا للصورة (يمكن للمستخدم التعديل وفقًا للحالة الفعلية، ويمكن ضبط قيمة البداية على 3-15، ويمكن ضبط قيمة النهاية على 5-20، تعديل) في الرسم البياني اللوغاريتمي. عند عتبة النافذة، يكون خط العتبة في الطور اللوغاريتمي، ومنحنى التضخيم للتحكم السلبي يكون خطًا مستقيمًا أو أسفل خط العتبة).
6 التحكم في الجودة (يتم تضمين التحكم الإجرائي في الاختبار) التحكم السلبي: لا يوجد منحنى تضخيم واضح لقنوات الكشف FAM وHEX وCY5
التحكم الإيجابي في COV: منحنى تضخيم واضح لقنوات الكشف FAM وHEX، قيمة Ct ≤32، ولكن لا يوجد منحنى تضخيم لقناة CY5؛
يجب استيفاء المتطلبات المذكورة أعلاه في نفس التجربة في وقت واحد، وإلا فإن التجربة غير صالحة ويجب تكرارها.
7 تحديد النتائج.
7.1 إذا لم يكن هناك منحنى تضخيم أو قيمة Ct> 40 في قنوات FAM وHEX لعينة الاختبار، وكان هناك منحنى تضخيم في قناة CY5، فيمكن الحكم على عدم وجود RNA لفيروس كورونا الجديد 2019 (2019-nCoV) في العينة؛
.2 إذا كانت عينة الاختبار تحتوي على منحنيات تضخيم واضحة في قنوات FAM وHEX، وكانت قيمة Ct ≤40، فيمكن الحكم على أن العينة إيجابية لفيروس كورونا الجديد 2019 (2019-nCoV).
7.3 إذا كان لعينة الاختبار منحنى تضخيم واضح في قناة واحدة فقط من قنوات FAM أو HEX، وكانت قيمة Ct ≤40، ولم يكن هناك منحنى تضخيم في القناة الأخرى، فيجب إعادة الاختبار. إذا كانت نتائج إعادة الاختبار متسقة، فيمكن اعتبار العينة إيجابية للاختبار الجديد.
فيروس كورونا المستجد 2019 (2019-nCoV). إذا كانت نتيجة إعادة الفحص سلبية، يُمكن اعتبار العينة سلبية لفيروس كورونا المستجد 2019 (2019-nCoV).
قيمة الحكم الإيجابي
يتم استخدام طريقة منحنى ROC لتحديد قيمة CT المرجعية للمجموعة وقيمة مرجع التحكم الداخلي هي 40.
تفسير نتائج الاختبار
١. يجب اختبار كل تجربة بحثًا عن عناصر تحكم سلبية وإيجابية. لا يمكن تحديد نتائج الاختبار إلا عندما تستوفي عناصر التحكم متطلبات مراقبة الجودة.
2. عندما تكون قنوات الكشف FAM وHEX موجبة، فقد تكون النتيجة من قناة CY5 (قناة التحكم الداخلية) سلبية بسبب منافسة النظام.
٣. عندما تكون نتيجة التحكم الداخلي سلبية، وإذا كانت قنوات الكشف FAM وHEX في أنبوب الاختبار سلبية أيضًا، فهذا يعني أن النظام معطل أو أن العملية خاطئة، وبالتالي فإن الاختبار غير صالح. لذلك، يجب إعادة اختبار العينات.
